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Genomic Analysis of ADAR1 Binding and its Involvement in Multiple RNA Processing Pathways

1.文章简介

文章题目 Genomic Analysis of ADAR1 Binding and its Involvement in Multiple RNA Processing Pathways
中文题目 ADAR1基因组结合位点分析及其参与的多个RNA加工途径
期刊名 Nat Commun   IF: 11.47
作者
发表时间 2015.09
实验材料 human U87MG cells
测序平台 Illumina HiSeq 2500 sequencer
相关产品 CLIP-seq

2.研究背景

ADAR(The proteins adenosine deaminases acting on RNA)是多细胞动物中腺苷转变为肌苷的主要调节因子。研究表明ADAR蛋白在生命的基本过程中都发挥着广泛的作用。ADAR1敲除鼠数据表明其缺失能够导致胚胎致死。ADAR2敲除之后小鼠仅能在出生后存活数天。ADAR蛋白之前被认为通过其dsRNA binding domain非特异性的结合dsRNA,然而近期研究表明,其结合靶序列还存在序列和结构的特异性,学者推测ADAR1偏向于结合至Alu重复序列,但是目前还缺乏全基因组范围的研究报道。同时研究表明,ADAR蛋白除了RNA编辑能力,可能还参与了基因表达的其它方面,例如选择性剪接、miRNA的生物合成以及冗余mRNA的降解等,但是这些结果还缺乏相关的具体机制研究。

3.研究内容

交联免疫沉淀结合高通量测序技术Cross-Linking Immunoprecipitation method followed by high-throughput sequencing (CLIP-Seq)被运用于全基因组水平揭示ADAR1靶序列的结合特点。结果表明,ADAR1在U87MG细胞中能够结合的靶序列总数为23782,其中分布在约10000个蛋白编码基因中。作者分析了靶序列的分布规律,其中大部分为Alu重复序列,第一次从全基因组水平确认了ADAR1对Alu的选择偏好性。同时,发现了15%的结合位点位于非Alu区域,进一步研究表明ADAR1结合至非Alu区域能够调控3′ UTR 的选择性使用以及pri-miRNA的生成。

4.研究思路

  1. 通过两个不同的抗体做CLIP-Seq实验,在全基因组范围内寻找ADAR1的结合序列;
  2. 分析ADAR1结合序列的序列特异性;
  3. ADAR1结合至非Alu区域的生物学意义研究。

5.文章亮点

本研究第一次全面地揭示了ADAR1在基因组中的结合序列的特异性分布,同时揭示了其在3′ UTR 的选择性使用的调控以及primiRNA的生成中的功能,为更好的理解该基因的功能提供了非常精彩的工作。

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6.研究成果

1.ADAR1全基因组范围内的CLIP-Seq研究

通过两个ADAR1抗体构建了两个独立的clip文库。每一个文库中都包含超过10million的reads map到人类基因组数据库;同时,两个文库不同的reads结果显示大多数的CLIP标签反映出相同的pool,关于ADAR1的互作RNA。数据表明,大多数的CLIP标签与Alu原件overlap。同时,利用传统的IP-RTPCR对标签中随机挑选的序列进行了验证,结果表明CLIP-seq实验结果是可信的。
2.ADAR1结合位点分析

通过两个不同抗体构建的文库,进行后续的高通量测序,分别发现了128852个和53715个基因簇,其中32876个为二者重复的基因簇。通过对两个已经报道的RBPs(RNA binding protein)的数据分析,得到了2461个基因簇的重复,为了凸显ARAD1的特异性binding位点,对这些重叠的基因进行排除后,得到23782个基因簇,包含10321个基因。研究表明,腺苷到肌苷的转变主要集中在Alu序列中,而且分布在非编码区域。CLIP-Seq结果也表明,ADAR1主要结合至内含子的Alu区域,从全基因组层面验证了之前的假说。另外,结果表明ADAR1还有15%的靶序列分布于非-Alu区域,而且主要集中在外显子编码区和UTRs区域。在非Alu位点中,10%和8%的序列为LINE和SINE重复序列,与之前报道一小部分的A-I编辑发生在这些重复序列中相一致。而还有75%以上的非Alu序列为非重复区域。
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3.ADAR1在Alu区域中的结合特点

ADAR1偏好性的结合至Alu区域,那么ADAR1的结合位点与靶序列中A-I的改变位点之间的关联性如何?作者通过分析发现,大量的reads分布在Alu正义链的右端,该区域可能通过形成RNA发卡结合被ADAR1所识别。同时,发现了ADAR1的结合位点与RNA编辑位点非常接近。
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4.ADAR1竞争性结合至非Alu区域影响3‘UTR的使用
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为了研究为何大量的ADAR1结合位点位于非Alu区域的3’ UTR区域,在ADAR1干扰U87MG细胞中进行了RNA-Seq去鉴定全基因组层面的3’UTR长度的差异。通过常规的3’UTR分析,提取了核心和延长的3’UTR可变形式的变化了的多聚腺苷化。其中,随机选取了四个目的序列进行验证,也支撑了seq结果。其中,ADAR1 KD细胞中3’UTR延长序列与ADAR1-CLIP位点重叠。该结果在变短的3’UTR中没有看到。说明ADAR1通过结合至3’UTR区域调控3’UTR的选择。多聚腺苷酸剪接相关因子CstF64,CstF64τ 和CF Im68 结合至3’UTR的现象出现了一定的变化,说明了ADAR1通过结合至非Alu区域,影响RNA多聚酰胺相关因子在RNA上的结合,从而影响ployA尾的长度。同时,作者发现ADAR1的RNA编辑能力与部分基因的3’UTR编辑相关(APH1B)。总的来说,ADAR1能够影响总多关键基因的多聚腺苷化,包括发育与分化、转录调控与代谢相关进程等。
5.ADAR1影响Pri-miRNAs
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除了编码基因,CLIP-seq结果显示ADAR1能够分别结合至primary,precursor和mature miRNAs(分别为220,37和25个)。其中最多的为pri-miRNA序列,可能与其长度相关,或者也可能与ADAR1在细胞核中的高丰度有关联。一些已知的ADAR1-CLIP编辑靶标miRNA也出现在结果中,也支撑了我们的结果的可信度。25个miRNAS的pri-miRNA和pre-miRNA均在结果中出现,提示了我们实验数据的高度覆盖。这些结果提示,ADAR1可能通过相互作用影响primiRNA加工过程。作者在U87MG细胞中分别过表达和敲除ADAR1,对miR-21和miR-34a的表达进行了qRT-PCR验证,发现ADAR1过表达后,这两个miRNA的pri-miRNA显著下降,成熟的miRNA显著上调,而ADAR1干扰后呈现相反的趋势。相反,pri-miR-100的加工过程则在ADAR1过表达细胞中出现下调,在敲除细胞中得到增强。
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为了进一步在全基因组层面验证该结论,作者在U87MG细胞中通过干扰或者过表达ADAR1,运用small-RNA sequencing进行了验证。数据分析结果显示,ADAR1能够通过与pri-miRNA结合显著增强miRNA的表达,同时,ADAR1的dsRNA结合能力与RNA编辑活性与miRNA的表达也是相关联的。作者也发现了ADAR1能够不依赖ssRNA与DROSHA和DGCR8相互作用,提示ADAR1能够通过与pri-miRNA的结合募集miRNA微处理复合体进行miRNA的剪接成熟。

原文出处:

Jae Hoon B, Jaegyoon A, Xianzhi L, et al. Genomic analysis of ADAR1 binding and its involvement in multiple RNA processing pathways. Nature Communications 6, Article number:6355.
.

菊子曰 菊子曰:将微博当博客用!
Category: CNS-Reading2015年12月21日
标签: CLIP-seq
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