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Discovery, Annotation, and Functional Analysis of Long Noncoding RNAs Controlling Cell-Cycle Gene Expression and Proliferation in Breast Cancer Cells

1.文章简介

文章题目

Discovery, Annotation, and Functional Analysis of Long Noncoding RNAs Controlling Cell-Cycle Gene Expression and Proliferation in Breast Cancer Cells

中文题目

乳腺癌细胞中控制细胞周期基因表达及增殖的LncRNAs的发现,注释及功能研究

期刊名

Molecular cell    IF: 14.018

发表时间

2015.07

实验材料

MCF-7 human breast cancer cells

测序平台

Illumina HiSeq 2000

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RNA-seq

2.研究背景

    1. LncRNA 长度大于200nt的非编码RNA,具有高度细胞特异性,新LncRNA有待发现及研究。
    2. 二代测序技术给LncRNAs的鉴定与注释带来了极大的便利。
    3. 研究表明LncRNA与疾病具有密切关系(细胞核及胞浆LncRNA具有不同的功能)。
    4. 多种癌症的发生于特定的LncRNA密切相关(prostate cancers: the lncRNAs SChLAP1,PCAT-1, PCGEM1, and PRNCR1; breast cancers : BCAR4)
    5. 乳腺癌发生过程中LncRNA的分子机制暂不清楚

3.研究方法

应用基因组学及分子生物学的方法对MCF-7乳腺癌细胞中LncRNA进行鉴定及功能研究。
研究思路

      1. MCF-7细胞中LncRNA基因鉴定
      2. LncRNA分析
      3. 组蛋白修饰,辅助因子及转录因子的分析
      4. 关联分析
      5. MCF-7细胞中特定LncRNA的功能研究

文章亮点

      1. 采用了GRO-seq及RNA-seq结合的方法更加全面地鉴定LncRNA(低丰度,不稳定)。
      2. 鉴定了乳腺癌细胞中的LncRNA,包括700多条新LncRNA。
      3. 对LncRNA与mRNA基因的进行了差异分析
      4. 乳腺癌细胞中LncRNA 152 及LncRNA 67调控细胞周期及基因表达的研究

4.研究成果

1.GRO-Seq及RNA-Seq数据整合分析MCF-7细胞的LncRNA及MCF-7细胞lncRNA长度,外显子结构,亚细胞分布及稳定性研究

为了对MCF-7细胞中lncRNA进行鉴定及注释,作者对E2处理MCF-7细胞后各个时间点的多种高通量测序方法获得数据进行了整合分析。分析流程主要有三部分:

  1. 对(poly A+)RNA-Seq(steady-state transcripts, E2处理0及3h)数据进行Mapping及 Aseeemble;
  2. 整合GRO-Seq的初始RNA表达谱(primary transcripts ortranscription units; 0, 10, 25, 40, and 160 min of E2);
  3. 根据长度,覆盖率,表达水平及编码情况进行数据处理(Fig. 1A)。

分析后在MCF-7细胞中获得了1888条lncRNA基因(命为lncM),其中有726条是在目前数据库中没有注释的lncRNA基因(Fig. 1B)。
作者对全细胞及各个细胞组分(胞浆,核质及染色质)进行了polyA+测序来评估lncRNA 的亚细胞分布及加工过程,发现胞浆中的 lncRNA剪切更完全,而核内的lncRNA常含有未剪切的内含子(Fig.1D)。接着,作者对胞浆lncRNA的长度及结构进行了探讨,发现成熟的lncRNA比mRNA更短(Fig. 1E),而lncRNA在外显子及启动子区域比内含子区域更具有一定的保守性(Fig. 1F)

2.各种细胞成分(胞浆,细胞核,染色质)中RNA分析

作者对各个细胞组分在总RNA中的比率进行了分析(Fig. 2A),同时对胞浆中RNA分析发现胞浆中lncM的分布要比codA及lncA小(Fig. 2B)。对lncRNA的稳定性研究发现,lncM及lncA比codA在steady-state的水平更低(Fig. 2C),而它们的转录水平则相差无几(Fig. 2C中),这可能是由于它们的低稳定性造成的。且细胞核中lncRNA比胞浆中的 lncRNA稳定性更差(Fig. 2E)。这些研究结果表明核内lncRNA的低稳定性导致很多核内 lncRNA在之前的鉴定注释中被遗漏,而本研究则利用了GRO-seq的优势提高了检测的灵敏度。

3.Divergent 及Antisense LncRNA Genes转录水平比Intergenic LncRNA Genes高

根据lncRNA的转录来源可分为lincRNA, antisense lncRNA及divergent lncRNA。在lncM中,有79%属于intergenic lncRNA, 有243(13%)属于divergent lncRNA,及159(8.4%)属于antisense lncRNA (Fig. 3A)。lncM与codA基因具有相似的转录模式(Fig. 3B)。AS及Div lncRNA的启动子区域组蛋白修饰比Inter lncRNA要高,lncRNA比mRNA在启动子及基因内的组蛋白修饰程度低(Fig. 3E)。

4.探讨乳腺癌细胞中lncRNA的功能

作者对304种癌组织、正常组织及细胞系的lncRNA及mRNA进行了差异表达分析,发现lncRNA比mRNA更具组织及细胞特异性(Fig. 4A)。根据lncRNA的表达模式可以预测乳腺癌细胞的类型(Fig. 4B)。作者对两个特定的lncRNA进行功能研究表明,lncRNA152及 lncRNA67与乳腺癌细胞生长及细胞周期相关基因表达密切相关(Fig. 4)

5.细胞增殖实验

si-RNA介导的lncRNA152或lncRNA67的knockdown能够显著地抑制MCF-7细胞的生长(Fig.5B),同时,konckdown实验表明lncRNA152及 lncRNA67能够调控大量基因的表达

6.lncRNA152及lncRNA67调控细胞周期及estrogen-dependent信号通路

它们在细胞各个周期的表达量具有明显的差异,且knock down实验表明,当它们的表达量被抑制后,细胞在G1发生了明显的累积(Fig. 6A)。然而,17β-estradiol (E2)对lncRNA152 及lncRNA67 的表达调控则相反,在E2刺激后lncRNA152的表达量发生了下调,而lncRNA67的表达量则发生了上调(Fig.6C). 当lncRNA152及lncR67被knockdown后,受estrogen调节的基因表达均受到抑制(Fig. 6D)。

原文出处:

Sun M, Gadad SS, Kim DS, Kraus WL, 2015.Discovery, Annotation, and Functional Analysis of Long Noncoding RNAs Controlling Cell-Cycle Gene Expression and Proliferation in Breast Cancer Cells. Mol Cell, 59(4):698-711.

Category: CNS-Reading2016年3月7日
标签: Circular-RNA
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