Discovery, Annotation, and Functional Analysis of Long Noncoding RNAs Controlling Cell-Cycle Gene Expression and Proliferation in Breast Cancer Cells

1.文章简介

2.研究背景

1. LncRNA 长度大于200nt的非编码RNA，具有高度细胞特异性，新LncRNA有待发现及研究。
2. 二代测序技术给LncRNAs的鉴定与注释带来了极大的便利。
3. 研究表明LncRNA与疾病具有密切关系（细胞核及胞浆LncRNA具有不同的功能）。
4. 多种癌症的发生于特定的LncRNA密切相关（prostate cancers: the lncRNAs SChLAP1,PCAT-1, PCGEM1, and PRNCR1; breast cancers : BCAR4）
5. 乳腺癌发生过程中LncRNA的分子机制暂不清楚

3.研究方法

应用基因组学及分子生物学的方法对MCF-7乳腺癌细胞中LncRNA进行鉴定及功能研究。
研究思路

1. MCF-7细胞中LncRNA基因鉴定
2. LncRNA分析
3. 组蛋白修饰，辅助因子及转录因子的分析
4. 关联分析
5. MCF-7细胞中特定LncRNA的功能研究

文章亮点

1. 采用了GRO-seq及RNA-seq结合的方法更加全面地鉴定LncRNA(低丰度，不稳定)。
2. 鉴定了乳腺癌细胞中的LncRNA，包括700多条新LncRNA。
3. 对LncRNA与mRNA基因的进行了差异分析
4. 乳腺癌细胞中LncRNA 152 及LncRNA 67调控细胞周期及基因表达的研究

4.研究成果

1.GRO-Seq及RNA-Seq数据整合分析MCF-7细胞的LncRNA及MCF-7细胞lncRNA长度，外显子结构，亚细胞分布及稳定性研究

为了对MCF-7细胞中lncRNA进行鉴定及注释，作者对E2处理MCF-7细胞后各个时间点的多种高通量测序方法获得数据进行了整合分析。分析流程主要有三部分：

1. 对（poly A+）RNA-Seq（steady-state transcripts， E2处理0及3h）数据进行Mapping及 Aseeemble；
2. 整合GRO-Seq的初始RNA表达谱（primary transcripts ortranscription units; 0, 10, 25, 40, and 160 min of E2）；
3. 根据长度，覆盖率，表达水平及编码情况进行数据处理（Fig. 1A）。

分析后在MCF-7细胞中获得了1888条lncRNA基因（命为lncM），其中有726条是在目前数据库中没有注释的lncRNA基因（Fig. 1B）。
作者对全细胞及各个细胞组分（胞浆，核质及染色质）进行了polyA+测序来评估lncRNA 的亚细胞分布及加工过程，发现胞浆中的 lncRNA剪切更完全，而核内的lncRNA常含有未剪切的内含子（Fig.1D）。接着，作者对胞浆lncRNA的长度及结构进行了探讨，发现成熟的lncRNA比mRNA更短（Fig. 1E），而lncRNA在外显子及启动子区域比内含子区域更具有一定的保守性（Fig. 1F）

2.各种细胞成分（胞浆，细胞核，染色质）中RNA分析

作者对各个细胞组分在总RNA中的比率进行了分析（Fig. 2A），同时对胞浆中RNA分析发现胞浆中lncM的分布要比codA及lncA小（Fig. 2B）。对lncRNA的稳定性研究发现，lncM及lncA比codA在steady-state的水平更低（Fig. 2C），而它们的转录水平则相差无几（Fig. 2C中），这可能是由于它们的低稳定性造成的。且细胞核中lncRNA比胞浆中的 lncRNA稳定性更差（Fig. 2E）。这些研究结果表明核内lncRNA的低稳定性导致很多核内 lncRNA在之前的鉴定注释中被遗漏，而本研究则利用了GRO-seq的优势提高了检测的灵敏度。

3.Divergent 及Antisense LncRNA Genes转录水平比Intergenic LncRNA Genes高

根据lncRNA的转录来源可分为lincRNA， antisense lncRNA及divergent lncRNA。在lncM中，有79%属于intergenic lncRNA， 有243（13%）属于divergent lncRNA，及159（8.4%）属于antisense lncRNA （Fig. 3A）。lncM与codA基因具有相似的转录模式（Fig. 3B）。AS及Div lncRNA的启动子区域组蛋白修饰比Inter lncRNA要高，lncRNA比mRNA在启动子及基因内的组蛋白修饰程度低（Fig. 3E）。

4.探讨乳腺癌细胞中lncRNA的功能

作者对304种癌组织、正常组织及细胞系的lncRNA及mRNA进行了差异表达分析，发现lncRNA比mRNA更具组织及细胞特异性（Fig. 4A）。根据lncRNA的表达模式可以预测乳腺癌细胞的类型（Fig. 4B）。作者对两个特定的lncRNA进行功能研究表明，lncRNA152及 lncRNA67与乳腺癌细胞生长及细胞周期相关基因表达密切相关（Fig. 4）

5.细胞增殖实验

si-RNA介导的lncRNA152或lncRNA67的knockdown能够显著地抑制MCF-7细胞的生长（Fig.5B），同时，konckdown实验表明lncRNA152及 lncRNA67能够调控大量基因的表达

6.lncRNA152及lncRNA67调控细胞周期及estrogen-dependent信号通路

它们在细胞各个周期的表达量具有明显的差异，且knock down实验表明，当它们的表达量被抑制后，细胞在G1发生了明显的累积（Fig. 6A）。然而，17β-estradiol (E2)对lncRNA152 及lncRNA67 的表达调控则相反，在E2刺激后lncRNA152的表达量发生了下调，而lncRNA67的表达量则发生了上调（Fig.6C). 当lncRNA152及lncR67被knockdown后，受estrogen调节的基因表达均受到抑制（Fig. 6D）。

原文出处：

Sun M, Gadad SS, Kim DS, Kraus WL, 2015.Discovery, Annotation, and Functional Analysis of Long Noncoding RNAs Controlling Cell-Cycle Gene Expression and Proliferation in Breast Cancer Cells. Mol Cell, 59(4):698-711.