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CRISPR/Cas9

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  • 技术流程

技术简介

CRISPR/Cas9技术是由RNA介导识别特定基因位点,Cas9蛋白发挥核酸酶切割DNA双链的基因组编辑技术,继锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。

 

凭借着成本低廉,操作方便,效率高等优点,CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室。通过人工设计的特异的gRNA指导Cas9蛋白在哺乳动物细胞中精确定位来实现精确编辑,即特定基因的沉默或插入。

 

使用CRISPR/Cas9技术可以更加容易而有效地敲除内源基因,同时避免了转染外源质粒带给细胞的未知影响(Figure 1)。

 

在RNA和蛋白质相互作用的研究中,常常由于缺少RBP的IP级抗体而受到限制。我们正在开发的技术可以突破这种限制,使得CLIP-seq等技术不再依赖于适合的抗体,从而扩大了RBP-RNA的研究范围。该技术通过CRISPR/Cas9的同源重组技术,在内源RBP位置上插入标签肽,实现用标签抗体捕获RBP的TAG-CLIP技术等(Figure 2)。

技术原理

当前,利用CRISPR/Cas9技术的研究人员首先需要构建一个sgRNA(single-guide RNA)。sgRNA中包含一段与目标DNA匹配的序列,被附着在Cas9酶上。将Cas9-sgRNA复合物引入到目标细胞后,sgRNA会找到与其匹配的DNA序列,然后,Cas9酶结合目标DNA序列,切断双链。接下来,筛选编辑成功的单克隆,进行扩大培养,获得成功编辑的细胞系。

技术流程

Figure 1 (Hsu, Lander et al. 2014)

Figure 2 (Van Nostrand, Gelboin-Burkhart et al. 2017)

参考文献:

Hsu, P. D., E. S. Lander and F. Zhang (2014). “Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.” Cell 157(6): 1262-1278.

Van Nostrand, E. L., C. Gelboin-Burkhart, R. Wang, G. A. Pratt, S. M. Blue and G. W. Yeo (2017). “CRISPR/Cas9-mediated integration enables TAG-eCLIP of endogenously tagged RNA binding proteins.” Methods 118: 50-59.

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武汉生命之美科技有限公司成立于2010年7月,是一家专注于将高通量测序技术(NGS)转化为科学发现和产业应用的生物高科技企业。生命之美使用新一代测序技术和RNA-蛋白质互作的科学技术优势,短短数年时间,就成长为一个拥有强大实验室和科研实力的合作平台。生命之美不但已经与各高校、研究所的实验室一起合作science,也启动了与普通大众一起science的模式,希望以健康产品服务每一名个体。生命之美为爱和梦想而来,它期待着与中国、一带一路各国乃至全球的伙伴们一起做一个前所未有的科学梦:用科学祝福全球!

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